DNA Ploidy by Flow Cytometry !!!

       Penghitungan konten DNA dengan flowsitometri tersedia untuk memberikan estimasi jumlah sel pada fase siklus sel tertentu (G0/1, S, atau G2M) dan DNA ploidy. Pada sebagian besar kasus DNA ploidy dianalisa pada jaringan darah atau pada tumor padat. Bukti adanya aneuploidi merupakan tanda definitif dari adanya tumor. Selain sebagai diagnosis, adanya aneuploidi juga merupakan parameter yang dilihat untuk memprediksi suatu prognosis dan hasil dari suatu terapi.

      Untuk memeriksa ploidi DNA dari suatu sampel tumor, hal yang harus dilakukan adalah membandingkan antara konten DNA dari populasi sel G0/G1 dari sel tumor dengan sel kontrol normal. Pada sel normal nilai puncak dari intensitas floresens dinyatakan dalam indeks DNA dengan nilai 1 (DI=1). Pada sel tumor DI dinyatakan sebagai rasio perbandingan antara nilai puncak floresens sel tumor dengan sel normal pada Go/1 seperti yang dinyatakan diatas. Terdapat juga analisa DI yang lazim dilakukan dengan membandingkan nilai modus intensitas foresen dibanfing menggunakan nilai puncaknya. Banyak autor lain masih cenderung menggunakan nilai rata-rata dari intensitas floresens populasi G0/1 daripada dengan menggunakan modus untuk mendapatkan rasio DI. Dari beberapa pendapat tersebut, pada intinya ketika pengukuran DNA dilakukan secara tepat, beberapa cara pendekatan di atas juga akan menunjukkan estimasi nilai DI yang sama dari sel aneuploidi. Sebagai sel kontrol biasanya digunakan limfosir dari pasien yang sama sebagai kontrol standar eksternal dari DI=1.

            Untuk meningkatkan nilai identifikasi DI, dibutuhkan pengunaan sel normal baik sebagai standar kontrol internal maupun eksternal. Ketika digunakan sebagai kontrol eksternal, sel tersebut ditujukan untuk menentukan prosedur pewarnaan dan pemrosesan serta penghitungan pada detektor laser yang identik dengan sampel tumor. Sel kontrol eksternal limfosit   sebaiknya dihitung baik sebelum dan sesudah penghitungan sampel tumor. Penghitungan ganda ini ditujukan untuk memungkinkan mendeteksi adanya kemungkinan perubahan pada pembacaan floresens misalnya akibat pengaturan yang salah pada instrumen pada penghitungan yang berjalan. Selain itu, kontrol eksternal, sel normal seharusnya dicampurkan dengan proporsi 1:1 dengan sampel sel tumor dan dapat digunakan sebagai kontrol internal pada paket penghitungan lain.

            Selain dapat diambil dari sel lain diluar jaringan tumor, kontrol internal juga dapat diambil pada jaringan tumor karena adanya sel stromal atau sel infiltrat yang normal  yang juga dapat digunakan sebagai kontrol internal dari ploidi DNA. Secara fakta, ketika ploidi DNA dianalisa pada penghitungan nukleus di jaringan yang telah diparafinisasi, kontrol internal dari adanya sel stromal atau sel infiltrat  normal merupakan satu-satunya cara dalam menganalisa ploidi DNA dari sel tumor. Hal ini dapat disebabkan karena kemampuan pewarnaan DNA setelah fiksasi dengan formaldehid dan parafinisasi mengalami perubahan sehingga penggunaanya sebagai standar eksternal tidak bisa bermanfaat lagi.

            Contoh dari penggunaan kontrol eksternal dan internal dapat ditemukan pada penggunaan eritrosit ayam dan limfosit. Sel eritrosit  ayam yang segar ataupun yang telah terfiksasi dapat digunakan sebagai kontrol internal. Sedangkan sel limfosit sebagai kontrol eksternal. Keduanya digunakan utnuk mengetahui konsistensi dari metode pengukuran seperti telihat pada gambar 1 dan 2 di bawah.

 GAMBAR 1.  Blood lymphocytes (blue) used as external control for DNA ploidy analysis by flow cytometry. DNA ploidy of liver biopsy from HCC patient (red).

GAMBAR 2. Chicken red blood cells can be used as internal control during

DNA ploidy analysis by flowcytoemtry.

Source:

Sa Wang et al. 2004. Detection of Aneuploid Neoplastic T Cells in the Blood Is Associated With Large Cell Transformation in Tissue. Am J Clin Pathol 2004;122:774-782.

Zbigniew Darzynkiewicz dan Gloria Juan.1997. DNA Content Measurement for DNA Ploidy. and Cell Cycle Analysis. Current Protocols in Cytometry (1997) 7.5.1-7.5.24.

--- TERIMAKASIH, SEMOGA BERMANFAAT ---

                                                                                                                

Read More

Application of Cell Cycle detection by Flow Cytometry !!!

Flowsitometri merupakan suatu metode yang diaplikasikan untuk mampu menganalisa berbagai komponen seluler (asam nukleat, lemak, protein dll),organel (lisosom, mitokondria dll), bahkan fungsi ( viabilitas, aktivitas enzimatis dll).Salah satu manfaat dari flowsitometri adalah analisa  siklus sel. Analisa siklus sel dengan flowsitometri merupakan hal yang menarik untuk dikaji baik pada penelitian dasar maupun pada ranah biomedik.

Penerapan analisis siklus sel pada berbagai bidang memiliki poteni yang besar untuk terus dikembangkan. Pada bidang farmakologi, flowsitometri menyediakan kesempatan untuk menyelidiki efek terapi obat secara in vitro seperti efikasi dari faktor-faktor anti tumor untuk mengembangkan terapi baru. Pada onkologi, jumlah DNA sel dan distribusinya pada berbagai fase dalam siklus sel dapat dianalisa untuk mendeteksi sel yang patologisuntuk menentukan prognosis maupun untuk monitoring terapi. Analisa siklus sel dengan flowsitometri juga tidak terbatas digunakan pada model eksperimen selain hewan dan famili tumbuhan tingkat tinggi saja, namun juga dapat digunakan untuk meningkatkan pengetahuan pada model eksperimen seperti bakteri, jamur, ataupun alga uniseluler. Untuk aplikasi analisa siklus sel dengan flowsitometri lainnya akan dijelaskan pada pembahasan di bawah ini:

A.    Farmakologi dan toksikologi

Analisa monoparametrik  atau multiparametrik  dari siklus sel termasuk studi kinetika dapat digunakan untuk mengevaluasi efek obat in vitro. Metode ini juga dapat digunakan untuk mengetahui sitotoksisitas, fase aksi sepesifik, pengaruh pada metaolisme sel atau posisi pada siklus dimana sel tersebut terbunuh oleh karena suatu obat. Oleh karena manfaat tersebut, metode ini dapat mengkarakterisasi  sifat obat dan memberikan prediksi efek obat in vivo dan mengevaluai sensitivitas atau resisitensi untuk dapat menentukan langkah selanjutnya termasuk penggantian terapi.

B.     Patologi tumoral

    1.      Diagnosis berdasarkan konten DNA

Berbagai tumor  baik ganas maupun lesi prekanker memiliki asosiasi dengan abnormalitas pada jumlah DNA yang didapat dari aberasi kromosomal. Sehingga, dibutuhkan informasi yang dapat didapat dari flowsitometri sehingga nantinya diperoleh informasi berupa indeks DNA. Indeks DNA merupakan rasio antara konten relatif DNA pada sel tumor pada fase G1 dengan  sel diploid normal.Ketika sel memiliki abnormalitas konten DNA, indeks DNA akan berbeda dari satu (1) dan disebut populasi aneuploid. Indeks DNA yang dihitung dengan flowsitometri  memiliki korelasi yang baik dengan jumlah kromosom terutama pada leukimia dan tumor padat.Populasi aneuploidi merupakan indikator yang baik untuk mengetahui adanya tumor ganas. Akan tetapi. Konten DNA memiliki keterbatasan sebagai metode diagnostik karena resolusi analisis kadangkala tidak cukup untuk menunjukkan populasi yang berbeda sedikit dengan sel diploid  seperti pada beberapa jenis leukimia.

2.      Nilai diagnostik berdasarkan aktivitas proliferasi  

Repartisi sel pada berbagai fase siklus sel  merupakan informasi yang penting olehkarena beberapa tumor memiliki karakter khas berupa proliferasi seluler yang tak terkontrol. Jumlah sel pada fase S, secara langsung yang memiliki hubungan erat dengan proliferasi merupakan hal yang menarik untuk dikaji. Akan tetapi, walaupun pada beberapa jenis tumor berkorelasi dengan tingginya angka proliferasi seperti pada acute myeloblastic leukemias dan limfoma, juga terdapat sel yang sangat rendah tingkat proliferasinya seperti acute lymphoblastic leukemias dantumor padat terutama tumor diploid. Oleh karena itu, proliferasi seluler memiliki keterbatasan sebagai alat diagnostik. Hal ini dapat disebabkan oleh karena perbedaan presentasi sel pada fase S (S%) tergantung pada besarnya tumor atau lokasi pengambilan.

       3.      Nilai prognosis dari analisa siklus sel

Manfaat lain dari flowsitometri  pada analisis siklus sel adalah sebagai parameter prognosituk pada reversi secara patologi. Pada beberapa kasus, tumor diploid memberikan hasil prognosis yang lebih baik daripada tumor aneuploidi yang berkorelasi pada nilai indeks DNA. Ketika tumor merupakan tumor aneuploidi,  remisi komplit  membutuhkan waktu yang lebih lama pada beberapa limfoma dan angka rekurensi sangat tinggi seperti pada tumor kandung kemih. Pada kasus leukimia atau mieloma, aneuploidi merupakan salah satu parameter prognosis yang buruk. Angka keselamatan pasien akan lebih baik jika S%  rendah. Parameter S% ini memiliki nilai prognosis pada tumor payudara namun kurang diteliti tidak seperti pada indeks DNA. Pada kasus limfoma, grading secara umum berkorelasi denagan proliferasinya, ketika ditemukan low grade dengan S% yang tinggi, limfoma tersebut kemungkinan akan bertransformasi menjadi bentuk high grade.

4.      Monitoring obat pada proses terapi

Flowsitometri  juga dapat digunakan sebagai alat monitoring terapi dengan menganalisa pada populasi tumor.  Metode ini dapat digunakan untuk mengevaluasi efek radioterapi atau kemoterapi Analisa dapat mendeteksi resistensi terhadap regimen terapi yang nantinya dapat menentukan keputusan berikutnya. Pada kasus leukimia dan limfoma, flowsitometri dapat menentukan efisiensi terapi. Metode ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi sel  tumor yang tersisa yang dapat menyebabkan relaps. Konten DNA dapat dianalisa secara bersamaan dengan indikator tumor untuk mendeteksi adanya modifikasi dari ekspresi yang mungkin menandai adanya transisi dari tingkatan keganasan tumor maupun respon terhadap terapi.

 C.    Aplikasi lainnya

Secara aplikasi selain pada terapi kanker dan farmakologi, masih banyak manfaat dari analisa siklus sel dengan flowsitometri. Analisis siklus sel secara luas terbukti mampu mengambil peran luas pada peningkatan pengetahuan dalam berbagai bidang ilmu seperti pada studi sperma dan sel testikular, atau pada interaksi antara virus dan sel. Analisa ini juga terbukti pada beberapa tipe sel lain diluar sel yang lazim dianalisa seperti pada bakteri, jamur, fitoplankton ataupun alga.

Pada studi sel testikular, analisa ini mampu membantu membedakan antara  sel haploid, diploid, dan tetraploid berdasarkan jumlah DNAnya. Selain itu, hasil yang lebih akurat mampu didapatkan berkat adanya analisa bivariat pada DNA dan RNA setelah pemberian pewarnaan dengan acridine orange atau setelah inkorporasi dengan BrdUrd. Analisa DNA juga ditujukan untuk mengetahui alterasi sel atau modifikasi pada berbagai  subpopulasi setelah terpapar oleh zat kimia tertentu  atau terpapar oleh radiasi ionik. Selain itu, terdapat kemungkinan dalam menentukan kualitas dari cairan semen atau untuk membedakan antara sel normal dengan sel tumor testis berdasarkan kondensasi kromatin seluler setelah in situ denaturasi DNA dan pewarnaan dengan acridine orange.

 Pada taraf interaksi virus dengan sel, beberapa studi yang fokus pada Simian virus 40 (SV40) mendapatkan bahwa sel yang terinfeksi terinduksi untuk melakukan sintesis DNA yang berkorelasi dengan peningkatan konten DNA. Analisa multiparametrik  pada konten DNA dan antigen T darusel yang terinfeksi SV40 juga telah dilakukan untuk membedakan gen yang diregulasi oleh siklus sel atau yang meregulasi siklus sel.

            Selain manfaat yang dapat diamati pada hewan atau pada tumbuhan tingkat tinggi, analisa siklus sel telah terealisasikan untuk diaplikasikan pada bakteri, terutama untuk proses studi efek obat. Analisa ini juga dapat digunakan untuk studi proses evolusi pada populasi jamur, efek stress lingkungan pada spesies fitoplankton ataupun proliferasi dari Euglena gracilis  akibat pengaruh vitamin B12.

 Source:

Chantal Jayat dan Marie Ratinaud. 1997. Cell cycle analysis by flow cytometry:  Principles and applications . Biol Cell (1993) 78, 15-25.

Rafael Nunez. 2001. DNA Measurement and Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. (2001) 3(3): 67-70.

--- TERIMA KASIH, SEMOGA BERMANFAAT ---

Read More