DNA Ploidy by Flow Cytometry !!!

       Penghitungan konten DNA dengan flowsitometri tersedia untuk memberikan estimasi jumlah sel pada fase siklus sel tertentu (G0/1, S, atau G2M) dan DNA ploidy. Pada sebagian besar kasus DNA ploidy dianalisa pada jaringan darah atau pada tumor padat. Bukti adanya aneuploidi merupakan tanda definitif dari adanya tumor. Selain sebagai diagnosis, adanya aneuploidi juga merupakan parameter yang dilihat untuk memprediksi suatu prognosis dan hasil dari suatu terapi.

      Untuk memeriksa ploidi DNA dari suatu sampel tumor, hal yang harus dilakukan adalah membandingkan antara konten DNA dari populasi sel G0/G1 dari sel tumor dengan sel kontrol normal. Pada sel normal nilai puncak dari intensitas floresens dinyatakan dalam indeks DNA dengan nilai 1 (DI=1). Pada sel tumor DI dinyatakan sebagai rasio perbandingan antara nilai puncak floresens sel tumor dengan sel normal pada Go/1 seperti yang dinyatakan diatas. Terdapat juga analisa DI yang lazim dilakukan dengan membandingkan nilai modus intensitas foresen dibanfing menggunakan nilai puncaknya. Banyak autor lain masih cenderung menggunakan nilai rata-rata dari intensitas floresens populasi G0/1 daripada dengan menggunakan modus untuk mendapatkan rasio DI. Dari beberapa pendapat tersebut, pada intinya ketika pengukuran DNA dilakukan secara tepat, beberapa cara pendekatan di atas juga akan menunjukkan estimasi nilai DI yang sama dari sel aneuploidi. Sebagai sel kontrol biasanya digunakan limfosir dari pasien yang sama sebagai kontrol standar eksternal dari DI=1.

            Untuk meningkatkan nilai identifikasi DI, dibutuhkan pengunaan sel normal baik sebagai standar kontrol internal maupun eksternal. Ketika digunakan sebagai kontrol eksternal, sel tersebut ditujukan untuk menentukan prosedur pewarnaan dan pemrosesan serta penghitungan pada detektor laser yang identik dengan sampel tumor. Sel kontrol eksternal limfosit   sebaiknya dihitung baik sebelum dan sesudah penghitungan sampel tumor. Penghitungan ganda ini ditujukan untuk memungkinkan mendeteksi adanya kemungkinan perubahan pada pembacaan floresens misalnya akibat pengaturan yang salah pada instrumen pada penghitungan yang berjalan. Selain itu, kontrol eksternal, sel normal seharusnya dicampurkan dengan proporsi 1:1 dengan sampel sel tumor dan dapat digunakan sebagai kontrol internal pada paket penghitungan lain.

            Selain dapat diambil dari sel lain diluar jaringan tumor, kontrol internal juga dapat diambil pada jaringan tumor karena adanya sel stromal atau sel infiltrat yang normal  yang juga dapat digunakan sebagai kontrol internal dari ploidi DNA. Secara fakta, ketika ploidi DNA dianalisa pada penghitungan nukleus di jaringan yang telah diparafinisasi, kontrol internal dari adanya sel stromal atau sel infiltrat  normal merupakan satu-satunya cara dalam menganalisa ploidi DNA dari sel tumor. Hal ini dapat disebabkan karena kemampuan pewarnaan DNA setelah fiksasi dengan formaldehid dan parafinisasi mengalami perubahan sehingga penggunaanya sebagai standar eksternal tidak bisa bermanfaat lagi.

            Contoh dari penggunaan kontrol eksternal dan internal dapat ditemukan pada penggunaan eritrosit ayam dan limfosit. Sel eritrosit  ayam yang segar ataupun yang telah terfiksasi dapat digunakan sebagai kontrol internal. Sedangkan sel limfosit sebagai kontrol eksternal. Keduanya digunakan utnuk mengetahui konsistensi dari metode pengukuran seperti telihat pada gambar 1 dan 2 di bawah.

 GAMBAR 1.  Blood lymphocytes (blue) used as external control for DNA ploidy analysis by flow cytometry. DNA ploidy of liver biopsy from HCC patient (red).

GAMBAR 2. Chicken red blood cells can be used as internal control during

DNA ploidy analysis by flowcytoemtry.

Source:

Sa Wang et al. 2004. Detection of Aneuploid Neoplastic T Cells in the Blood Is Associated With Large Cell Transformation in Tissue. Am J Clin Pathol 2004;122:774-782.

Zbigniew Darzynkiewicz dan Gloria Juan.1997. DNA Content Measurement for DNA Ploidy. and Cell Cycle Analysis. Current Protocols in Cytometry (1997) 7.5.1-7.5.24.

--- TERIMAKASIH, SEMOGA BERMANFAAT ---